Библиотека ДИССЕРТАЦИЙ

Главная страница Каталог

Новые диссертации Авторефераты
Книги
Статьи
О сайте
Авторские права
О защите
Для авторов
Бюллетень ВАК
Аспирантам
Новости
Поиск
Конференции
Полезные ссылки Перевод текста

Введите слово для поиска

Мосин Олег Викторович. Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н (D) И 13С, с высокими степенями изотопного обогащения

03.00.23-Биотехнология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва -1996

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:
доктор химических наук, профессор, член корреспондент РАМН, В. И. ШВЕЦ,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Д. А. СКЛАДНЕВ.

Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Н. Ф. МЯСОЕДОВ.
кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Б. М. ПОЛАНУЕР.

Ведущая организация:
Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ "ГОСНИИСИНТЕЗБЕЛОК".

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность работы. В настоящее время во всем мире растет интерес к природным соединениям, меченным стабильными изотопами, в частности дейтерием 2Н (D) и углеродом 13С, которые незаменимы для разнопрофильных биомедицинских и диагностических целей, структурно-функциональных исследований, а также для изучения клеточного метаболизма разнообразных биологически активных соединений (БАС) с использованием стабильных изотопов.

Тенденции к применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения: спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), инфракрасной и лазерной спектроскопией, масс-спектрометрией. Развитие этих современных методов за последние годы позволило усовершенствовать проведение многочисленных биологических исследований de novo, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне. Зачастую для данных исследований необходимо, чтобы молекулы синтезируемых БАС имели как можно более высокие степени изотопного обогащения.

Именно поэтому разработка путей биосинтетического получения БАС с высокими степенями изотопного обогащения является очень актуальной задачей для современной биотехнологии и отечественной микробиологической промышленности. С развитием новых биотехнологических подходов в последнее время появилась возможность получать разнообразные стабильно меченные соединения за счёт биологической конверсии сравнительно дешёвых дейтерированных субстратов дейтерометанола и тяжёлой воды CD3OD/D2O в генетически сконструированных штаммах бактерий (О.В. Мосин, Д.А. Складнев). Однако опробированные в лабораторных условиях процессы редко применяются в биотехнологии из-за наличия ряда трудностей, связанных с клеточной адаптацией к тяжёлой воде (D2O).

Целью данной работы была разработка методов биотехнологического получения молекул аминокислот, белков и нуклеозидов, меченных дейтерием и изотопом углерода 13С с высокими степенями изотопного обогащения.

Поскольку биосинтетический потенциал исследуемых штаммов за счёт конверсии тяжёлой воды к началу проведения данной работы был изучен недостаточно, в рамках работы представляло интерес исследование принципиальной возможности их адаптации к росту на средах содержащих тяжёлую воду для синтеза меченных целевых продуктов. Для этого были разработаны специальные биотехнологические подходы по получению меченных БАС, что позволило подойти к реализации комплексного использования химических компонентов биомассы полученных штаммов-продуцентов и созданию новых безотходных микробиологических производств по получению изотопно-меченных молекул БАС на их основе.

Научная новизна работы заключается в следующих аспектах:

1. Предложен метод получения штаммов-продуцентов БАС, устойчивых к максимальным концентрациям тяжёлой воды в ростовой среде.

2. Показана перспективность использования суммарных химических компонентов биомассы метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, полученных в результате многоступенчатой адаптации к тяжёлой воде для биосинтеза дейтерий-меченных молекул аминокислот, белков и нуклеозидов.

3. Разработаны методы получения изотопно-меченных молекул БАС, основанные на использовании высокоактивных штаммов-продуцентов, адаптированных к росту и биосинтезу на средах с высокими концентрациями тяжёлой воды. Получены с высокими выходами индивидуальные дейтерий- и углерод-меченные 13С - аминокислоты (степени изотопного включения в молекулы составляют до 97,5% от общего количества атомов водорода в молекуле), [1,3',4',2,8-D5]-инозин (степень включения дейтерия в молекулу 62,5% от общего количества атомов водорода в молекуле) и дейтерий-меченный бактериородопсин с селективным и униформным характером включения метки в молекулу.

4. Разработаны общие принципы масс-спектрометрического анализа степеней изотопного обогащения мультикомпонентных смесей аминокислот при данном способе введения метки за счёт применения прямой обработки (дериватизации) культуральной жидкости и белковых гидролизатов дансилхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.

Практическая значимость: Полученные в работе результаты могут быть использованы для создания новых безотходных производств по синтезу изотопно-меченных молекул БАС. В частности, основанных на использовании биологической конверсии дешёвых меченных низкомолекулярных субстратов в дорогостоящие клеточные БАС.

Положения, выносимые на защиту:

1. Подбор условий получения биомассы штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum с униформным характером обогащения клеточных БАС дейтерием. Использование гидролизатов дейтеро-биомассы данного штамма для биосинтеза дейтсрий-меченного инозина и бактериородопсина.

2.Методы получения дейтерий- и 13С -аминокислот, [1',3',4',2,8-D5] -инозина и бактериородопсина за счёт биологической конверсии дейтерометанола/13С метанола СDзОD/13СНзОН и тяжёлой воды D2O.

3.Метод прямой химической модификации интактных культуральных жидкостей дансиллхлоридом/карбобензоксихлоридом и диазометаном.

Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов, выводов. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков и 15 таблиц.

Запрос на автореферат диссертации "Разработка методов биотехнологического получения белков, аминокислот и нуклеозидов, меченных 2Н (D) И 13С, с высокими степенями изотопного обогащения" присылайте на адрес kulseg@mail.ru

Биология
Ветеринария
Геология
Искусствоведение
История
Культурология
Медицина
Педагогика
Политика
Психология
Сельхоз
Социология
Техника
Физ-мат
Филология
Философия
Химия
Экономика
Юриспруденция

Подписаться на новости библиотеки

Пишите нам
X