Библиотека ДИССЕРТАЦИЙ

Главная страница


Новые диссертации Авторефераты
Книги
Статьи
О сайте
Авторские права
О защите
Для авторов
Бюллетень ВАК
Аспирантам
Новости
Поиск
Объявления
Конференции
Полезные ссылки

Введите слово для поиска


Миронова Екатерина Валентиновна.
Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ТОНКОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Специальность 03.00.23 - Биотехнология.

ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:
доктор химических наук Ходонов А.А.
доктор биологических наук, с.н.с. Складнев Д.А.

Москва, 2002

Содержание диссертации
Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина

Введение

Обзор литературы.Галофильные бактерии и бактериородопсин в современной биотехнологии
1. Галобактерии
1.1. Применение галофильных бактерий в биотехнологии
1.2. Halobacterium salinarum
2. Пурпурные мембраны и родопсины галобактерии
3. Бактериородопсин: структура и функции
4. Основные способы изменения параметров фотоцикла бактериородопсина
4.1. Физико-химические воздействия
4.2. Замена хромофора
4.3. Точечные замены аминокислот
5. Техническое применение бактериородопсина
5.1. Бактериородопсин как фотохромный молекулярный материал
5.2. Создание голографических изображений на пленках, содержащих бактериородопсин
5.3. Голографическая интерферометрия
5.4. Обработка видеоизображений
5.5. Молекулярная память на основе бактериородопсина
5.6. Молекулярные фоторецепторы на основе бактериородопсина

теоретическая часть и обсуждение результатов
1. Выбор объектов исследования
2. Окислительная модификация триметилциклогексенового кольца ретиноидов
3. Синтез аналогов ретиналя
4. Хромофорная полость бактериородопсина
5. Анализ данных по влиянию точечных мутаций аминокислотной последовательности на свойства бактериородопсина
6. Аналоги бактериородопсина
6.1. Культивирование salinarum
6.2. Получение аналогов бактериородопсина
6.3. Стабильность препаратов бактериородопсина при длительном хранении
6.4. Особенности фотоцикла аналогов бактериородопсина

Экспериментальная часть
1. Синтез аналогов ретиналя
2. Получение препаратов пурпурных мембран
3. Получение аналогов бактериородопсина

Выводы
Благодарности
Список литературы
Акт об использовании препаратов бактериородопсина

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Галофильные бактерии и бактериородопсин в современной биотехнологии

1. Галобактерии

Галобактерии относят к архебактериям, которые представляют собой совершенно особую линию эволюции, отличающуюся как от прокариот, так и от эукариот. Эти бактерии распространены там, где есть подходящие условия для их роста: высокое содержание NaCl и других необходимых ионов, в соленых природных водоемах, бассейнах для выпаривания соли, белковых материалах (рыба, мясо), консервируемых с помощью соли [3].

В 1960-х годах начались первые эксперименты по культивированию и выделению галофильных бактерий [4-6]. Всего за прошедший период было выделено около 170 природных штаммов. В основном это были умеренно галофильные микро¬организмы, только несколько штаммов оказались экстремальными галофилами [7].

Бактерии, которым для роста необходимо присутствие NaCl, по степени галофильности делят на несколько типов. Наиболее широко используют классификацию по диапазону концентраций NaCl, в котором могут расти данные микроорганизмы, предложенную Kushner D.J. [8]: галотоллерантные (от 0 до 5% NaCl), экстремально галотоллерантные (0 до 15% NaCl), легкие галофилы (около 3% NaCl), умеренные галофилы (от 3 до 15% NaCl), пограничные экстремальные галофилы (>15% NaCl), экстремальные галофилы (около 25% NaCl).

В IX издании определителя бактерий Берджи [9] экстремально галофильные архебактерии объединены в порядок Halobacteriales, семейство Halobacteriaceae, которое включает 6 родов и более 20 видов, различающихся формой клеток, способностью к движению, отношением к кислотности среды, устойчивостью к NaCl и другими признаками.

Исследование биохимии галобактерии позволило предложить целый ряд вариантов применения этих микроорганизмов в биотехнологии.

1.1. Применение галофильных бактерий в биотехнологии

Способность галобактерии выживать в экстремальных условиях повышенной концентрации соли и интенсивной инсоляции обусловлена приобретенной в процессе эволюции высокой стабильностью клеточных компонент к разрушительным внешним воздействиям. Это обуславливает значительный потенциал галобактерии для биотехнологии [10]. Их большим технологическим преимуществом так же является возможность культивирования в открытом резервуаре без риска загрязнения как окружающей среды так и самой культуры.

Ниже приведены основные направления использования галофильных бактерий и синтезируемых ими веществ в биотехнологии.

1. Бактериородопсин. Хотя БР обнаружен во многих штаммах экстремально галофильных бактерий, для его производства используют Halobacterium salinarum, содержащий значительные количества БР. Уникальные фотохимические свойства этого белка делают возможным его широкое техническое применение в биоэлектронике. Подробно этот вопрос будет рассмотрен в 5 разделе настоящего обзора литературы.

2. Осмотически активные вещества (осмолиты). Основной их функцией в клетках галобактерий является поддержание положительного водного баланса с внешней средой, которая обладает более высокой ионной силой. Такими веществами (см. рис. 1) служат водорастворимые сахара, спирты, аминокислоты и их производные. Они накапливаются в клетках в значительных количествах, а при резком уменьшении ионной силы среды быстро секретируются. Это дает возможность легкого разделения живых клеток бактерий и синтезируемых ими осмотически активных веществ при помощи простой процедуры центрифугирования, что позволяет осуществить их эффективное биосинтетическое производство. Получаемые из галобактерий осмотически активные вещества могут быть использованы в качестве стабилизаторов клеток и биомолекул (белков, нуклеиновых кислот, мембран), в косметической промышленности, как антагонисты соли и криопротекторы.

Один из наиболее распространенных осмолитов - эктоин. Он может быть произведен только биотехнологическими методами из Halomonas elongata [12], причем разработанный процесс позволяет получать до 155 мг эктоина на 1 г сухого веса биомассы бактерий.

3. Биодеградация отходов. Способность некоторых галофильных микроорганизмов окислять углеводороды и расти в соленой среде дает возможность использовать их для биологической очистки морских экосистем, загрязненных нефтепродуктами [13].

4. Биополимеры галобактерий. Биосурфактанты и экзополисахариды, синтезируемые многими галобактериями [14, 15], при контакте с нефтью снижают ее поверхностное натяжение, что может быть использовано при нефтедобыче. Хотя такие препараты дороги по сравнению с синтетическими аналогами, они являются биодеградируемыми и не наносят вреда окружающей среде. Галобактериальные биополимеры могут найти достаточно широкое применение и в медицине. Один из примеров - сульфатированные экзополисахариды, которые препятствуют проникновению вирусов в клетки. Был предложен эффективный метод их производства иммобилизованными клетками галофильных цианобактерий [16].

Еще одним примером может служить использование галобактериальных липидов для создания липосом. Поскольку липиды галобактерий содержат дигидрофитол, они значительно более стабильны, чем липиды ацильного типа, содержащие эфиры жирных кислот. Например, получаемые из полярных липидов Halobacterium cutirubrum липосомы устойчивы к действию фосфолипаз Аг и В и могут храниться в присутствии воздуха более 60 дней [17]. Полигидроксиалканоаты - внутриклеточные полимеры галобактерий, по своим свойствам некоторые из них напоминают полиэтилен [18]. Эти биодеградируемые полимеры во многих случаях могут с успехом заменить углеводородные аналоги, поскольку их производство достаточно дешево. Например, Haloferax mediterranei, культивируемые на крахмалосодержащей среде, накапливают полиф-гидроксимасляную кислоту) в количестве до 60% сухого веса [19]. Легкость выделения и высокая экологическая чистота производства этого полимера обусловлены тем, что лизис клеток вызывается воздействием на них дистилированной воды.

5. Ферменты. Ряд галобактериальных гидролаз могут быть использованы для получения аминокислот D-ряда (являющихся полупродуктами в синтезе многих антибиотиков, пептидных гормонов и пестицидов) и в пептидном синтезе [20-21]. Однако общим недостатком галобактериальных ферментов является необходимость достаточно высоких концентраций соли для поддержания их активности и нативного состояния.

6. Пищевая биотехнология. Галотолерантные микроорганизмы играют существенную роль при ферментации в присутствии соли. Происходящее с их помощью брожение придает продуктам характерный вкус и запах, что используется для производства некоторых маринадов и соусов [22, 23].

Так же из биомассы галобактерий можно получать различные пищевые добавки и красители. Например, биомасса антарктических морских бактерий содержит значительные количества полиненасыщенных жирных кислот [24, 25] и может быть использована для их производства, что значительно дешевле, чем реализуемое в настоящее время производство на основе рыбного сырья.

В России осуществляется производство комплексной пищевой добавки на основе биомассы галобактерий Halobacterium salinarum [26]. В настоящее время отечественные препараты, содержащие лиофилизированную биомассу этих галобактерий («Баксин» и «Баксиновая мазь»), прошли клинические испытания на эффективность и безопасность в условиях in vitro и in vivo. Доказано антиоксидантное и радиопротекторное действие препарата «Баксин» и получено разрешение на его применение в качестве пищевой добавки на территории РФ. На основании клинических испытаний «Баксиновая мазь» рекомендована к применению как противовоспалительное, регенерирующее и кератопластическое средство в комплексной терапии ряда хронических заболеваний кожи и в хирургической практике.

1.2. Halobacterium salinarum

Различные штаммы Halobacterium salinarum в настоящее время используются для производства БР. Следует отметить, что с момента обнаружения этих бактерий несколько раз меняли их названия. Штамм галобактерий, первоначально использованный для выделения и изучения БР, был получен из коллекции культур под названием Halobacterium halobium. Однако позднее было показано, что он неотличим от других штаммов, например, Н. salinarium жН. cutirubrum [27]. В 1996 г. была вновь пересмотрена номенклатура галобактерий [28] и официальным названием представителей этих штаммов семейства Halobacteriacea стало Halobacterium salinarum. Исходное видовое название salinarium было изменено на salinarum, являющееся родительным падежом латинского названия соляных копей «salinae».

Бактерии Н. salinarum представляют собой подвижные палочковидные микроорганизмы размером 0,5x5 мкм [29], обитающие в высококонцентрированных или насыщенных солевых средах. Они размножаются делением пополам и движутся при помощи полярных жгутиков [3]. Зрелые клетки сохраняют палочковидную форму в 3,5—4 М NaCl, при более низких концентрациях появляются полиморфные клетки, а при концентрации NaCl равной 1.5 М клетки становятся сферическими в результате набухания и утраты клеточной стенки и частично лизируют. Так же полное разрушение клеточных структур происходит при одновременном уменьшении концентрации NaCl и MgCb ниже 2 M и 20 мМ соответственно [3, 30], причем это явление в очень малой степени связано с осмотическим шоком. Такое высокое сродство галофилов к солям связано с тем, что белки, входящие в состав их клеток, содержат много кислых аминокислот и мало неполярных аминокислот [30], поэтому для поддержания их нативного состояния необходима высокая концентрация соли, которая препятствует их агрегации [3].

Природные штаммы Н. salinarum имеют желтую или оранжевую окраску, что связано с высоким содержанием в них каротиноидов. Каротиноиды, являющиеся основными пигментами клеток галобактерий, защищают их от интенсивной коротковолновой радиации, которой они подвержены в естественных условиях обитания [31]. Содержание каротиноидов, основным из которых является бактериоруберин (см. рис. 2) [32, 33], в природных штаммах, salinarum составляет 7-10% от суммарной липидной фракции [30].

Первоначально [30] исследователи использовали штамм Н. halobium Ri, являющийся спонтанным мутантом, halobium NRC34020 и не образующий газовых вакуолей, которые, как и пурпурные мембраны (ПМ), устойчивы в отсутствии солей и мешают их выделению. Из этого штамма путем мутагенеза были получены различные производные, в частности, не синтезирующие основных каротиноидов и ретиналя или имеющие повышенное содержание БР.

2. Пурпурные мембраны и родопсины галобактерий

В 1966 г. в поисках доказательства того, что мембраны имеют бислойную структуру с внедренными в нее белками, Oesterhelt D. et. al. [27] обнаружили участки поверхности клеток галобактерий Н. salinarum, выглядевшие под электронным микроскопом более гладкими, чем соседние участки и обычные мембраны. В 1971 г. было определено, что входящий в их состав белок сходен по структуре с родопсином [1, 34], по этой причине он был назван бактериородопсин.

Участки мембран, содержащие большое количество БР благодаря характерной окраске были названы пурпурные мембраны (ПМ). ПМ содержат сам белок (около 75% по сухому весу), некоторые липиды, каротиноиды и воду [3, 29, 35]. Обычно они занимают до 50% поверхности клетки и имеют округлую форму [29, 35] и размер около 0,5 мкм. Суммируя результаты исследования свойств ПМ, проводимых в течение последних трех десятилетий, можно отметить следующие их особенности [2, 36]:
• Состоят из липидов и БР в молярном соотношении 10:1 и весовом 1:3 [37, 38];
• Образуют двумерную гексагональную кристаллическую решетку из одинаково ориентированных тримеров БР;
• Имеют среднюю плотность 1.18 г/см и показатель преломления 1.45 - 1.55;
• Имеют размер около 0,5 мкм и толщину около 5 нм;
• Обладают повышенной устойчивостью:
• к действию солнечного света в присутствии кислорода (устойчивы в течение нескольких лет);
• к действию повышенных температур (до 80°С в водной суспензии и до 140°С в сухих пленках) [39];
• практически при любом значении рН (от 0 до 12); о при высокой ионной силе раствора (ЗМ NaCl);
• к действию многих протеаз [40, 41];
• к действию неполярных растворителей (например, гексана), но неустойчивы по отношению к полярным растворителям в смеси с водой (этанол, ацетон) [42]
• Сохраняют окраску и фотохимическую активность при практически полном удалении воды;
• Существует возможность встраивания ИМ в полимерные матрицы без потери фотохимических свойств [36];

Химический анализ [37] показал, что пурпурные мембраны состоят на 75% (по сухому весу) из белка (БР) и на 25% из фосфо- и гликолипидов (рис. 2), что, как отмечено выше, соответствует приблизительно десяти молекулам липидов на одну молекулу белка. Более точно липидный состав ИМ был определен при помощи метода ЯМР на ядрах :Н и 31Р в сочетании с масс-спектрометрией [38], хотя следует учитывать, что он может несколько изменяться в зависимости от условий культивирования галобактерий.

Липиды обладают характерной для галобактерий особенностью: они содержат остатки дигидрофитола, присоединенных простой эфирной связью, что значительно повышает их устойчивость по сравнению с липидамиацильного типа, встречающимися у остальных живых организмов.

Запрос на полный текст диссертации присылайте на kulseg@mail.ru



КСМ: продвижение сайтов
Пишите нам
X