Библиотека ДИССЕРТАЦИЙ

Главная страница Каталог

Новые диссертации Авторефераты
Книги
Статьи
О сайте
Авторские права
О защите
Для авторов
Бюллетень ВАК
Аспирантам
Новости
Поиск
Объявления
Конференции
Полезные ссылки

Введите слово для поиска

Коробова Светлана Вячеславовна.
Иммунореактивность рекомбинантых белков ВИЧ

ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ ФЕДЕРАЛЬНОГО УПРАВЛЕНИЯ «МЕДБИОЭКСТРЕМ» ПРИ МИНЗДРАВЕ РОССИИ

Специальность 14.00.36 – аллергология и иммунология

Диссертация
на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный консультант:
Доктор биологических наук И.А. Николаева
Кандидат биологических наук Э.В. Карамов

Москва 2002 г.

Содержание диссертации
Иммунореактивность рекомбинантых белков ВИЧ

Введение

1. Литературный обзор

Введение

1.1. Иммунный ответ против ВИЧ
1.1.1. Гуморальный ответ
1.1.2. Основные нейтрализующие эпитопы
1.1.3. Клеточный ответ
1.2. Вакцины против ВИЧ/СПИД
1.2.1. Вакцины на основе рекомбинантных векторов
1.2.2. Вакцины на основе живого аттенуированного вируса
1.2.3. ДНК вакцины и стратегия прайм/буст
1.2.4. Вакцины на основе рекомбинантных белков и субъединичных антигенов
1.3. Модели ВИЧ – инфекции/СПИД
1.4. Клинические испытания кандидатных вакцин против вич/спид
1.4.1. Гуморальный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД
1.4.2. Основные результаты клинических испытаний
1.4.3. Клеточный ответ на вакцинацию людей против ВИЧ/СПИД
1.4.4. Основные результаты клинических испытаний

2. Материалы и методы
2.1. Рекомбинантные белки и их конъюгаты с Полиоксидонием
2.2. Методика изучения иммуногенных свойств рекомбинантных белков ВИЧ1
2.2.1. Иммунизация мышей
2.2.2. Твердофазный непрямой иммунофементный анализ
2.2.3. Иммунометрический ( «сэндвич») метод ИФА
2.2.4. Иммунизация кроликов
2.2.5. Постановка твердофазного иммуноферментного анализа
2.2.6. Постановка иммунометрического «сэндвич» метода ИФА
2.3. Методика изучения иммуногенности белка rec(24-41) при введении высоких и низких доз препарата
2.4. Методика изучения иммуногенности конъюгата химерного рекомбинантного белка rec (24-41) c полиоксидонием rec (24-41)
2.5. Проведение иммуноблота с сыворотками животных, иммунизированных rec(24-41)
2.6. Проведение ИФА c сыворотками животных, иммунизированных rec(24-41) с использованием антигенов коммерческих тест-систем
2.7. Проведение теста нейтрализации
2.7.1. Иммунизация животных
2.7.2. Постановка реакции нейтрализации
2.8. Проведение реакции бластной трансформации лимфоцитов
2.9. Проведение ИФА и иммуноблота для изучения специфической активности rec(24-41)
2.9.1. Проведение ИФА с сыворотками людей, инфицированных ВИЧ1
2.9.2. Проведение ИФА с поликлональными антителами барана против вирусного белка р24 из коммерческого набора GENETIC SYSTEMS HIV-1 AG EIA
2.9.3. Проведение иммуноблота с сыворотками людей инфицированных ВИЧ1
2.9.3.1. Проведение электрофореза в полиакриламидном геле
2.9.3.2. Постановка иммуноблота


3. Результаты и обсуждение

3.1. Изучение иммуногенных свойств рекомбинантных белков ВИЧ1
3.2. Изучение специфической активности rec(24-41)
3.2.1. Изучение специфической активности rec(24-41) в ИФА
3.2.2. Изучение специфической активности rec(24-41) в иммуноблоте
3.3. Изучение специфической активности сывороток мышей, иммунизированных rec (24-41)
3.4. Изучение иммунногенности рекомбинантных белков ВИЧ при введении высоких и низких доз антигенов
3.5. Изучение иммуногенных свойств конъюгата рекомбинантного белка rec (24-41) с полиоксидонием
3.6. Исследование нейтрализующей активности сывороток мышей, иммунизированных rec (24-41)
3.7. Изучение пролиферативной активности клеток, животных иммунизированных rec (24-41)

Заключение
Выводы
Список сокращений
Список литературы

1.1. ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРОТИВ ВИЧ

1.1.1. Гуморальный ответ

Антитела - единственный компонент адаптивного иммунного ответа, способный предотвратить проникновение вируса в клетку. Обычно эффективность используемых современных вакцин определяется по уровню антител, который они взывают у иммунизированных. Следует сказать, что ВИЧ хорошо защищен от иммунного ответа хозяина. Вирусный оболочечный белок gp120 имеет ряд особенностей, которые ограничивают способность антител связываться с ним. Он сильно гликозилирован и представлен в олигомерной форме. Поэтому, несмотря на то, что ВИЧ вызывает образование, у инфицированных высоких титров антител, они, как правило, не способны нейтрализовать его [19]. Механизм нейтрализующего действия антител остается спорным. Существуют две основные точки зрения, объясняющие его. Одна из них – наличие на белках оболочки вируса эпитопов, связывание с которыми специфическими (нейтрализующими) антителами приводит к нейтрализации вируса [62,158,161,141,122], согласно другой, нейтрализующий эффект возникает, когда плотность антител, покрывающих поверхность вириона, достигает определенного уровня [20].

Нейтрализующие антитела впервые обнаруживаются между 2 и 6 месяцем после острой первичной инфекции [90,117]. Нейтрализующие эпитопы вируса были выявлены при изучении моноклональных антител (МАТ), полученных на различные области белков gp120 и gp41.

1.1.2. Основные нейтрализующие эпитопы

V3. Третья вариабельная петля (V3) gp120 была определена как основной нейтрализующий эпитоп при изучении нейтрализации культурального вируса сыворотками ВИЧ-инфицированных и иммунизированных gp120 людей [164,153].

Механизм нейтрализации основан на ингибировани антителами связывание комплекса gp120-CD4 с корецептором [178,160,72] , однако, полученные к нему МАТ не обладали нейтрализующей активностью по отношению к первичным изолятам [17].

CD4bd. Большинство антител у инфицированных ВИЧ людей распознают непрерывные или конформационные эпитопы, иммунодоминантным является домен связывания с СD4 [115]. Полученное к нему МАТ b12, распознающее домен связывания CD4 и часть V2 петли, обладает нейтрализующей активностью по отношению не только к культуральному вирусу, но и к большинству первичных изолятов [18,141].

V2. МАТ к ножке петли V1/V2 распознают конформационные эпитопы, расположенные в центральной области V2 петли [118]. Два МАТ специфически связывающиеся с V2 петлей, нейтрализуют ряд первичных изолятов вируса [58,168].

2G12. Эпитоп расположен в основании V3 и V4 петли и, возможно, включает углеводные структуры в С2 , С3, С4 и V4 доменов gp120. Полученное к нему МАТ 2G12 нейтрализует первичные изоляты вируса[161].

2F5: единственный нейтрализующий эпитоп, МАТ (2F5) к которому нейтрализовало первичные изоляты [122,123,33,19]. Он расположен на мембране проксимальной части эктодомена (662-667 ак.) и имеет линейную структуру ELDKWA.

Таким образом, в составе белков оболочки было выявлено три основных нейтрализующих эпитопа: два – конформационных расположены на gp120, третий находится на gp41, и имеет линейное строение. Антитела к ним выявляются лишь у небольшого количества инфицированных ВИЧ, что свидетельствует об их невысокой иммуногенности. Возможно, это объясняется тем, что при инфицировании большинство антител образуется на белок – предшественник gp120 и gp41 - gp160, т.е. он является иммунодоминантным, поэтому ответ на зрелые белки, имеющие более низкую концентрацию, подавляется. Полученные моноклональные антитела могут послужить основой для создания терапевтического вакцинного препарата. Это было показано в следующем эксперименте. Обезьяны были разбиты на четыре группы. Первой группе, (n=4, n-количество обезьян) ввели моноклональные антитела 2G12, 15 мг/кг, второй (n=5) – смесь 2G12 и 2F5, 15 мг/кг, третьей (n=5) - смесь из ВИЧ-специфических иммуноглобулинов (Ig) и моноклональных антител- 2G12 и 2F5 400 мг/кг, четвертая, контрольная получила ВИЧ специфический иммуноглобулин 400 мг/кг.

Через 24 часа их инфицировали ВИОЧ. У всех обезьян из контрольной группы было отмечено снижение уровня CD4+ клеток и высокий уровень вируса в крови. У 8 из 14 иммунизированных обезьян вирус не обнаруживался как в культуре ПМНК, так и в ПЦР в клетках лимфатических узлов, т.е. полностью защищенными оказались 4 из 5 обезьян третьей группы, 2 из 5 второй группы и 2 из 4 первой группы. Пассивное введение обезьянам 2F5 МАТ, хотя и не защищало их от инфицирования первичными изолятами вируса, но способствовало более медленному течению болезни и сниженному уровню РНК вируса в крови [173].

Смесь трех МАТ нейтрализует большинство первичных изолятов in vitro. Однако, иммунизация пептидами и белками, содержащими последовательность для 2F5 эпитопа, не вызывала образование нейтрализующих антител.

Не было выявлено закономерностей между нейтрализующими серотипами, генетическими субтипами и биологическими свойствами (тропностью) вируса [119]. Так, при изучении нейтрализующей активности сывороток крови людей, инфицированных вирусами, относящихся к субтипу А, B, C, D в тесте нейтрализации, оказалось, что все они нейтрализуют вирус, относящийся к субтипу В. Все сыворотки нейтрализовали его в разведении 1:64. При этом, были нейтрализованы как М-тропные так и Т-тропные штаммы вируса [173].

Ряд опытов in vitro показал, что некоторые антитела, не имеющие специфической активности против вирусных белков, так же могут нейтрализовать вирус. Большинство из них направлены на белки клеточной мембраны, такие как ICAM-1 (CD54), LFA-1 (CD11a/CD18), HLA-DR, ?2-микроглобулин, МНС1 [56,140,3].

Другой мишенью для антител, могут быть регуляторные белки, например, tat, высвобождение, которого из инфицированных клеток [45,175,26], приводит к активации репликации вируса в соседних клетках [54]. tat вызывает активацию экспрессии ко-рецепторов ВИЧ и способствует проникновению вируса в клетку [98,75]. Оказалось, что антитела против tat ингибировали HIV-1IIIB in vitro и изх наличие коррелировало с отсутствием развития СПИДа in vivo [136,184].

Нейтрализующая активность сывороток редко обнаруживается во время острой инфекции. Таким образом, нейтрализующие антитела не играют обычно существенной роли в контролировании ВИЧ инфекции.

Помимо нейтрализации, антитела принимают участие в другом механизме борьбы с ВИЧ – антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ). Он основан на том, что антитела, с одной стороны, связываются с белками вируса на поверхности инфицированной клетки (клетка мишень) а с другой стороны с эффекторной клеткой, имеющей рецептор для Fc конца антитела. Это взаимодействие приводит к лизису или апоптозу клетки – мишени [51]. Connick et al. обнаружили антитела, обусловливающие АЗКЦ у ряда инфицированных ВИЧ людей, в то время как CD8+ ответ у них не определялся [35]. Также было показано, что уровень АЗКЦ, определенный хромовым методом, обратно коррелирует с уровнем вирусной нагрузки [50]. Антитела, определяющие АЗКЦ, относятся к изотипу G1[100].

Другой способ защиты обусловлен тем, что натуральные киллеры (НК) при стимуляции их Fc рецептора выделяют ?-хемокины, которые в свою очередь блокирую ко-рецепторы ВИЧ, лигандами для которых они являются [71].

При анализе распределения антител против антигенов ВИЧ по принадлежности к субклассам была выявлена следующая закономерность: большая часть образующихся антител принадлежит к субклассу G1. Эти антитела имеют анти-env специфичность [86,108,85,107]. Такую же специфичность имеют и IgG2 антитела. IgG3 направлены на gag и особенно на матриксный белок р17 [86,108,85].

IgG3 чаще выявляются на ранних стадиях инфекции [100]. Рестриктность гуморального ответа на гены gag и env отражает различные пути регуляторных механизмов иммунного ответа против этих белков. Это объясняет, почему титр анти gag антител понижается раньше, чем чем анти env в процессе ВИЧ инфекции [92,61,172,15]. Антитела изотипа IgG4 направлен также против gag, но встречается в основном у гемофиликов, зараженных путем переливания крови. Обнаружено, что наличие антител против внутренних белков вируса имеет обратную корреляцию с уровнем антигена в крови [87].

1.1.3. Клеточный ответ

СD8+ цитотоксические Т лимфоциты распознают вирусные белки в виде коротких пептидов состоящих из 8-11 аминокислот в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости первого типа (МНС1) на поверхности инфицированной клетки [159]. Распознавание комплекса МНС1 и вирусного пептида происходит Т клеточным рецептором (ТКР) совместно с СD8 корецептором, что приводит к функциональной активации ЦТЛ [171,174,134].

Прямой лизис инфицированной клетки обусловлен высвобождением перфорина и протеаз из литических гранул ЦТЛ в кальций - зависимом процессе. Интеграция перфорина в клеточную мембрану клетки-мишени приводит к образованию пор диаметром 16 нм и осмотической гибели клетки [78]. Протеазы, проникая в клетку, вызывают ее апоптоз [155]. Кальций-независимая клеточная цитотоксичность опосредована специфическими лигандами, такими как Fas-лиганды, которые при взаимодействии с ТКР запускают апоптоз клетки-мишени [79,88,124].

Клеточный ответ играет главную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции [185]. Это было показано при исследовании людей, хронически инфицированных вирусом, но не развившим клиническую картину болезни, имевшим нормальный уровень CD4+ клеток и низкий или недетектируемый уровень вирусной РНК, в отсутствие специфической антиретровирусной терапии. Оказалось, что у большинства из них развивался сильный антиген-зависимый лимфопролиферативный ответ к внутреннему белку вируса р24 или высокая специфическая цитотоксическая активность [143]. Анализ линейной регрессии показал значительную негативную корреляцию (r=-0,8,P<0,006) между вирусной нагрузкой и CD4+ лимфопролиферативным ответом к р24 [143].

Важная роль СD8+ ЦТЛ была подтверждена в следующем опыте: при удалении вирус - специфических CD8+ клеток с помощью цитотоксических моноклональных анти CD8+ антител, у инфицированных ВИОЧ обезьян происходило увеличение вирусной нагрузки, и развивалась иммуносупрессия [146,77].

У серонегативных гамбийских проституток, имеющих множественные половые контакты с инфицированными ВИЧ партнерами, но остающихся незараженными, у них была отмечена специфическая ВИЧ ЦТЛ активность в ПМК [95, 52,144].

Вирус - специфические CD8+ и CD4+ клетки обнаруживаются практически на всех стадиях ВИЧ – инфекции. Во время острой стадии их количество составляет 2-10% и 1-2% при хронической инфекции, в терминальной стадии они практически не обнаруживаются [112]. Снижение функциональной активности специфических ЦТЛ происходит по разным причинам. Прежде всего, сами CD4+ являются клетками-мишенями для вируса, при этом вирус - специфические CD4+ Th клетки подвергаются клональной делеции на ранних стадиях инфекции, т.к. именно они активируются в ответ на стимуляцию вирусом, что способствует их заражению.

Этот процесс идет настолько быстро, что не успевают образоваться вирус - специфические клетки-памяти. Было также показано, что ВИЧ-специфические Т клетки памяти содержат большее количество провирусной ДНК, по сравнению с другими клетками на всех стадиях болезни [42]. Инфицированные клетки разрушаются за счет прямого цитопатического действия вируса и ЦТЛ [27].

Значительная часть CD4+ клеток погибает за счет апоптоза. Существуют и другие механизмы, с помощью которых вирусу удается избежать иммунного ответа. Так, оболочечные белки вируса вызывают анергию CD4+ клеток. Все это приводит к тому, что ЦТЛ не получают дополнительной активации со стороны Th клеток и не могут нормально функционировать. У инфицированных ВИЧ отмечено снижение уровня перфорина у ЦТЛ. Кроме того, высокая генетическая изменчивость вируса предотвращает распознавание инфицированных клеток специфическими ЦТЛ.

Вирусные мутации ведут к делеции эпитопов, снижению связывания вирусных пептидов с МНС1, неэффективному процессингу вирусных белков и сниженному распознаванию ТКР [112].

Вирусный белок nef повышает экспрессию FasL (CD95L), индуцирующих апоптоз ВИЧ - специфических ЦТЛ [180]. nef также снижает экспрессию молекул MHC1 [130, 145, 32] на поверхности зараженной клетки, что затрудняет распознавание их натуральными киллерами. Этот процесс имеет аллельную специфичность и не включает HLA C и Е. Однако, опосредованный натуральными киллерами лизис инфицированных клеток ингибируется у людей имеющих HLA C и Е. [162,163,183,93].

У некоторых натуральных киллеров имеется рецептор NKB1, специфичный для Bw4 популяции HLA B клеток. Инфицированные ВИЧ люди, относящиеся к этой популяции, характеризуются медленным развитием болезни [68,69,114].

Было показано, что эффективность клеточного иммунного ответа определяется HLA генотипом хозяина [80, 82, 154 , 104, 24]. Отмечено, что болезнь развивается быстрее у людей, имеющих гаплотип HLA B35 и HLA A1/B8/DR3, а медленнее у HLA B27 и HLA B57, это продукты МНС1 и HLA DRB1* 13-DQB1* 06, продукты МНС II [80, 81, 111, 24]. Оказалось, что фрагмент gag (251-270 а.к.) имеет высокую аффиность к DRB1* 13. Этот пептид распознается клонами Т-клеток, выделенных из пациентов с высоким Т клеточным ответом.

Высокоаффинное связывание коррелирует с увеличенной плотностью комплексов МНС-пептид на антиген - представляющей клетке, что приводит к увеличению плотности сигнальных ТКР и развитию Th1 ответа [133,84,63].

Вирусный белок tat ингибирует 20S протеосому и ее регулятор 11S, что приводит неэффективному представлению некоторых вирусных эпитопов [147, 149].

Нецитолитический контроль инфекции ВИЧ включает СС хемокин-опосредованную блокаду вируса через конкуренцию лиганда к корецептору с V3 доменом оболочечного гликопротеина gp120 и супрессию репликации в CD4+ клетках на уровне транскрипции плохо охарактеризованным растворимым агентом, называемым CD8+ Т клеточным антивирусным фактором [30, 31, 96, 181].

Запрос на полный текст диссертации присылайте на адрес kulseg@mail.ru

Биология
Ветеринария
География
Искусствоведение
История
Культурология
Медицина
Педагогика
Политика
Психология
Сельхоз
Социология
Техника
Физ-мат
Филология
Философия
Химия
Экономика
Юриспруденция

Подписаться на новости библиотеки

Пишите нам
X