Библиотека ДИССЕРТАЦИЙ

Главная страница Каталог

Новые диссертации Авторефераты
Книги
Статьи
О сайте
Авторские права
О защите
Для авторов
Бюллетень ВАК
Аспирантам
Новости
Поиск
Объявления
Конференции
Полезные ссылки

Введите слово для поиска

Колганова Татьяна Владимировна.
Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

03.00.07 - микробиология
03.00.15 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:
кбн, с.н.с. Осипова И.Г.
кмн, доцент Васильева Е.А.

Москва 2003

Содержание диссертации
Корректирующее действие пробиотиков при экспериментальном дисбактериозе

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Нормофлора и ее роль в обеспечении колоницационной резистентности организма

Глава 2. Адгезия как первый этап колонизационного процесса

Глава 3. Нарушения колонизационной резистентности - дисбиозы. Модели дисбактеризов
3.1. Инфекции, вызываемые энтерогеморрагическими Escherichia coli
3.2. Урогенитальные инфекции, как следствие дисбиоза

Глава 4. Профилактика и лечение дисбиозов
4.1. Использование пробиотиков в терапии дисбиозов
4.2. Низкоинтенсивное импульсное лазерное излучение (НИЛИ) в терапии инфекционных заболеваний

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 1. Материалы и методы
1. Материалы
2. Методы
2.1. Идентификация бактерий
2.2. Методы исследования бактериальной адгезии
2.2.1. Тест агрегации дрожжей
2.2.2. Тест «исследование адгезии к иммобилизированным субстратам» (Growth assay)
2.2.3. Обогащение культур микроорганизмов клетками, экспрессирующими пили I типа
2.2.4.Радионуклеидное исследование адгезии
2.2.5. Формалинизация эритроцитов
2.2.6. Исследование адгезии к эритроцитам
2.2.7. Исследование адгезии микроорганизмов к клеткам защечного эпителия
2.2.8. Исследование связывание протеина FimH с пероксидазой хрена
2.2.9. Обработка ферментами ASG и РРО
2.2.10. Обработка НИЛИ
2.3. Определение антагонистической активности методом отсроченного антагонизма
2.4. Моделирование дисбактериоза у животных
2.5. Исследование транслокации кишечной флоры в органы и ткани
2.6. Методы работы с ДНК
2.6.1. Выделение плазмидной ДНК
2.6.2. Обработка ДНК
2.6.3. Методы введения генетического материала в клетку
2.6.3.1. Кальциевая трансформация
2.6.3.2. Конъюгация и мобилизация
2.7. Оценка продукции колицина и чувствительности бактерий к его действию
2.7.1. Тест с верхним агаром
2.8. Методы статистической обработки результатов исследований

Глава 2. Получение генноинженерных вариантов штамма E.coli
2.1. конструирование плазмид ColAmob и pCollac
2.2. получение штаммов E.coli M17/ pCollacZ, E.coii M17/ ColAmob, E.coli fimH::npt/pCollacZ, E.coii M17fimH::npt/pColAmob

Глава З. Антагонистическая активность нормальной микрофлоры по отношению к патогенным Escherichia coli

Глава 4. Сравнительное исследование адгезивной активности различных групп пробиотиков

Глава 5. Исследование влияния на уровень адгезии различных штаммов E.coli физико-химических факторов
5.1. Влияние низкочастотного инфракрасного лазерного излучение на уровень адгезии патогенных E.coli к различным субстратам
5.1.1. Исследование влияния НИЛИ на уровень жизнеспособности E.coli
5.1.2. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к эритроцитам
5.1.3. Изменение адгезии патогенных E.coli под влиянием обработки НИЛИ эритроцитов
5.1.4. Влияние НИЛИ на уровень адгезии патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия
5.2. Влияние обработки ферментами L-Аспарагиназой и Полифенол оксидазой на уровень адгезии E.coli к различным субстратам
5.2.1. Определение бактерицидных свойств ферментов ASG и РРО
5.2.2. Определение эффективной антиадгезивной концентрации ASG и РРО
5.2.3. Исследование влияния ферментов L-Аспарагиназы и Полифенол оксидазы на адгезию патогенных E.coli к эритроцитам
5.2.4. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию патогенных E.coli к клеткам защечного эпителия
5.2.5. Исследование влияния ферментов ASG и РРО на адгезию E.coli в опытах "Исследования адгезии к иммобилизированным субстратами радионуклеидном исследовании адгезии"
5.2.6. Исследование влияния ASG и РРО на величину связывания очищенного протеина FimH с пероксидазои хрена в реакции ELISA
5.3. Влияние комплексной обработки НИЛИ и ферментами ASG и РРО на уровень адгезии E.coli
5.4. Влияние НИЛИ и ферментов РРО и ASG на адгезивную активность пробиотиков

Глава 6. Исследование защитного действия пробиотиков на модели in vivo
6.1. Отработка модели дисбактериоза на мышах
6.2. Моделирование инфекционного процесса, вызванного E.coli О157:Н7
6.3. Использование пробиотиков для профилактики и лечения инфекции, вызванной E.coli 0157:Н7

ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение

Известно, что основной функцией нормальной микрофлоры человека является обеспечение колонизационной резистентности (КР) пищеварительного тракта. В обычных условиях поддержание КР микрофлорой осуществляется за счет продукции антибиотических веществ, конкуренции за места адгезии, подавления адгезии условнопатогенных бактерий, ингибирования транслокации и ряда опосредованных механизмов [88].

Факторы, способствующие нарушению состава микрофлоры и приводящие к развитию дисбактериозов, весьма многочисленны: это и прием лекарственных препаратов различных групп, стрессы, неблагоприятная экологическая обстановка, неправильный рацион питания, голодание. При антибиотикотерапии в первую очередь в нормобиоценозе исчезают "нормальные" кишечные палочки, и их место занимают условно патогенные и патогенные эшерихии, способные вызывать как местные, так и генерализованные инфекционно-воспалительные процессы. Причиной и характерным признаком дисбактериоза является избыточный рост патогенных и условно патогенных микроорганизмов в биотопе, что, в свою очередь, способствует их колонизации в нетипичных эконишах. Поэтому до настоящего времени актуальным является исследование и разработка новых подходов к коррекции дисбактериозов, одним из которых является разработка новых пробиотиков (ПБ), в том числе на основе нормальной кишечной палочки.

Одним из первых отечественных ПБ является колибактерин. Штамм E.coli А. Ниссле [45], входивший в состав колибактерина, за годы эксплуатации утратил плазмиду, детерминирующую колициногенность, в связи с чем снизил антагонистическую активность в отношении ряда бактерий, чувствительных к действию колицина [64].

Считается, что основным требованием при подборе производственных штаммов для препаратов - ПБ должна быть их высокая колонизационная активность [131,132]. При этом особое внимание следует обращать на такие факторы колонизации как антагонистическая и адгезивная активности.

Адгезивная активность является первым этапом развития колонизационного процесса и в большинстве случаев желательна для ПБ, тогда как у патогенных микроорганизмов рассматривается в качестве одного из стартовых механизмов развития инфекции. Таким образом, при подборе ПБ для коррекции дисбиоза, вызванного тем или иным патогеном, целесообразно сравнение адгезивных свойств патогена и ПБ с целью выяснить, может ли данный ПБ конкурировать с патогеном за субстраты связывания и тем самым препятствовать колонизации последнего в организме.

Одной из важнейших задач при коррекции дисбиозов является удаление патогенов из экониш. Блокирование адгезии патогенов к субстратам связывания может предотвратить развитие инфекции на раннем этапе. Из литературы известны вещества, способные блокировать адгезию микроорганизмов, среди которых пептиды, моно и олигосахариды, ферменты, в том числе полифенол оксидаза (РРО). Известна так же способность физических факторов таких, как ультразвуковое воздействие, низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), снижать адгезивную активность. Но если блокирование адгезии патогенов целесообразно, то снижение адгезивности нормальной флоры нежелательно, в ряде случаев это может привести к неблагоприятным последствиям. Отсюда очевидна актуальность поиска агентов, способных избирательно ингибировать адгезивность патогенов, воздействуя при этом незначительно на нормофлору.

Имеется положительный опыт применения низкоинтенсивного импульсного лазерного излучения (НИЛИ) в различных областях медицины, в частности в урологии для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний. Опубликован ряд работ, посвященных воздействию НИЛИ на организм человека и на отдельные его клеточные субпопуляции, но о воздействии НИЛИ на микроорганизм сведений в литературе очень мало. Известно только, что достигаемая с помощью такого лечебного воздействия быстрая санация мочевыводящего тракта у больных позволяет предположить возможное воздействие НИЛИ не только на макроорганизм, но и на микроорганизмы.

В настоящее время при доклиническом изучении ПБ руководствуются, в основном, методами in vitro, так как отсутствует эффективная экспериментальная модель дисбактериоза на животных. Наиболее информативная - модель на гнотобиотических животных. Однако работа с ними требует наличия специальных условий и оборудования. Поэтому, предложено несколько способов моделировать дисбактериоз у «микробных» животных. Дисбактериоз вызывается посредством тотальной кровопотери, голодания, стресовых ситуаций, радиационного облучения, приема антибиотиков. Последний способ изучался В.Г. Лиходедом с соавт. [28,34,60]. Ими в частности было доказано, что введение мышам больших доз ампиокса сопровождается значительным снижением клеточного и гуморального антиэндотоксинового иммунитета.

Учитывая всё вышеизложенное, настоящая работа преследовала цель изучить корректирующее действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе.

Для достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:
1. Сконструировать на базе известной плазмиды Со1Е1 гибридные плазмиды, несущие детерминанту синтеза колицина и лишенные генов mob, контролирующих конъюгативную мобилизацию плазмиды.
2. Получить и исследовать новые рекомбинантные варианты производственного штамма М-17 способные к продукции колицина Е1.
3. Изучить антагонистическую активность новых рекомбинантных ПБ в отношение патогенных клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.
4. Провести сравнительное изучение адгезивной активности ПБ различных групп (бифидо, лакто, колисодержащих, споровых и грибов) и клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.
5. Изучить влияние физико-химического воздействия (НИЛИ и ферментов L-аспарагиназы (ASG) и полифенол оксидазы (РРО)) на адгезию микроорганизмов.
6. Разработать адекватную модель дисбактериоза для оценки эффективности ПБ на животных.
7. Изучить защитное действие ПБ при экспериментальном дисбактериозе у животных.

Научная новизна:
1. Впервые на основе родительской плазмиды Со1Е1 получены новые плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ, а так же рекомбинантные штаммы, содержащие полученные плазмиды: E.coli M-17/pCollacZ, М-17 fimH::npt/pCollacZ, М-17/Со1ДтоЬ, М-17 fimH::npt/Colflmob, Штаммы обладают способностью к продукции колицина Е1, при этом сконструированные плазмиды лишены mob области и вследствие этого не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами.

2. Впервые изучена антагонистическая активность новых рекомбинантных штаммов и коммерческих ПБ различных групп в отношении клинических штаммов E.coli, выделенных от пациентов с дисбиозами.

3. Впервые исследовано влияние НИЛИ на адгезивные свойствы E.coli и установлена бульшая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию НИЛИ по сравнению с ПБ.

4. Впервые исследовано влияние ферментов ASG и РРО на адгезивную активность микроорганизмов и установлена бульшая чувствительность патогенов к антиадгезивному действию ферментов по сравнению с ПБ.

5. Разработана модифицированная модель экспериментального дисбактериоза на животных. При этом для доказательства наличия дисбактериоза впервые использован штамм E.coli О157:Н7 (212), вызывающий геморрагический колит.

6. Впервые предложен способ коррекции геморрагического колита с помощью ПБ: генноинженерных вариантов штаммов М-17, а так же коммерческих препаратов - биофлора, биоспорина, лактобактерина, колибактерина.

Практическая значимость.
1. Представлены новые научные данные о механизме защитного действия ПБ.
2. Предложена новая модель для изучения дисбактериоза с использованием мышей. Доказана эффективность применения ПБ для профилактики и лечения дисбактериозов на этой модели.
3. In vitro доказана возможность комплексного использования ПБ, НИЛИ и ферментов РРО и ASG для предотвращения колонизации патогенов.
4. Получены новые рекомбинантные варианты пробиотического штамма E.coli M-17, обладающие способностью синтеза колицина Е1, которые могут быть использованы для разработки пробиотических препаратов.

Полученные данные можно использовать в лекционном материале по микробиологии в разделах нормальная флора, дисбактериозы и пробиотики.

Положения, выносимые на защиту.
1. Сконструированные плазмиды pCollacZ и СоЩтоЬ содержат детерминанту синтеза колицина Е1 (сеа), ген иммунности к нему (imm), не способны к мобилизации конъюгативными плазмидами (не содержат mob области), стабильно поддерживаются в популяции (за счет наличия гена сег) и пригодны для использования в качестве факторов, придающих родительскому штамму E.coli M 17 способность к синтезу колицина Е1 и вследствие этого повышенную антагонистическую активность в отношении патогенов.

2. Полученные рекомбинантные штаммы, а так же колисодержащие ПБ в опытах in vitro проявляют высокий уровень антагонистической активности в отношении клинических штаммов патогенных E.coli , выделенных от больных с дисбиозами, тогда как споровые пробиотики и энтерол обладают низким уровнем антагонизма в отношение изучаемых штаммов.

3. Воздействие НИЛИ блокирует адгезины уропатогенных E.coli, и тем самым предотвращает колонизацию этих патогенов в организме. Обработка эритроцитов НИЛИ приводит к ингибированию рецепторов, что также выражается в частности снижением адгезии. Патогенные E.coli в значительной мере более чувствительны к воздействию НИЛИ, чем представители нормофлоры.

4. Ферменты ASG и РРО обладают свойством снижать уровень адгезивности микроорганизмов на различных моделях и экспериментах in vitro: иммобилизированные субстраты, эукариотические клетки (эритроциты и клетки защечного эпителия) и др. ПБ значительно менее чувствительны к воздействию ферментов посравнению с патогенными E.coli.

5. Получена адекватная модель дисбактериоза у животных для исследования эффективности ПБ. В качестве маркёра наличия дисбактериоза использован штамм E.coli 0157:Н7.

6. ПБ обладают протективным действием в отношении клинического штамма E.coli О157:Н7 на модели in vivo.

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. НОРМОФЛОРА И ЕЕ РОЛЬ В ОБЕСПЕЧЕНИИ КОЛОНИЦАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА

Термин колонизационная резистентность (КР) впервые введен Van der Waaij D., под ним понимают совокупность взаимосвязанных физиологических, микробиологических и иммунологических факторов организма, препятствующих колонизации организма патогенами [14]. КР обеспечивается за счет нормальной перистальтики кишечника [194], препятствующей избыточной колонизации тонкой кишки, а так же благодаря нормофлоре, играющей в поддержании КР основную роль [88].

Нормальной следует считать эволюционно сложившуюся микрофлору, которая формировалась во взаимодействии с организмом человека в течение основного периода его существования как биологического вида [55].

До настоящего времени нет общепринятой классификации нормальной микрофлоры [180], однако, чаще всего принято подразделять нормальную микрофлору кишечника здоровых людей и животных на индигенную, транзиторную и факультативную. Нормофлору подразделяют так же на облигатную и факультативную. Количество и функции основных представителей нормофлоры приведены в таблице 1. В то время, как роль транзиторной микрофлоры в настоящее время активно изучается, основная функция индигенной микрофлоры известна и заключается в поддержании КР. Микроорганизмы индигенной микрофлоры в составе биопленки в сотни раз более устойчивы к воздействию неблагоприятных факторов по сравнению с бактериями находящимися в просвете кишечника. Микрофлора характеризуется неоднородностью и относительным постоянством в разных отделах желудочно-кишечного тракта. Подсчитано, что в кишечном тракте взрослого человека количество микроорганизмов составляет 1013, т.е. почти равно числу клеток всех тканей и органов макроорганизма [61].

О многокомпонентности микрофлоры человека говорит хотя бы тот факт, что в 1.0 г содержимого слепой кишки обнаруживается около двух биллионов микроорганизмов, представителей 17 различных семейств, 45 родов и свыше 400 различных видов [17,138,158]. Количество индигенных видов среди них невелико, но численность их значительна [49], и они, колонизуя поверхность клеток слизистой, обитают в толще слоя муцина, покрывающего эпителий.

Муцин в комплексе с бактериями представляет собой специфическую биопленку, защищающую энтероциты от действия чужеродных агентов [16,62,81]. Доказано свойство бактерий нормофлоры индуцировать экспрессию гена, кодирующего синтез кишечного муцина MUC2 and MUC3, причем экспрессия наблюдалась лишь в клетках линии НТ-29 (кишечный эпителий), тогда как клетки неинтестинальной линии НЕр-2 в тех же условиях продуцировали лишь минимальное количество MUC2 mRNA и не продуцировали MUC3 mRNA. Добавление в среду MUC2 и MUC3 муцинов понижала уровень адгезии патогенных кишечных палочек к эукариотическим клеткам, как первой, так и второй линии [81,168,170]. Важнейшим механизмом обеспечения КР является конкурирующее действие микроорганизмов за экологическую нишу, осуществляющееся благодаря проявлению бактериями нормофлоры разнообразных свойств [183,189,201,240].

Бактерии нормофлоры обладают антагонистической активностью в отношении патогенных микроорганизмов. Понятие антагонистической активности очень широко и складывается из многих составляющих, среди которых более высокая скорость размножения бактерий нормофлоры, более широкий набор ферментов, а также продукция различных бактерицидных и бактериостатических субстанций [184,197]. Среди таких веществ, продуцируемые лакто и бифидобактериями органические жирные кислоты, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенам. Лактобактерии, бифидобактерии и особенно кишечная палочка способны к синтезу бактериоцинов - естественных антибиотикоподобных веществ [164,223]. Так субстанции, выделяемые бифидобактериями, ингибируют рост таких патогенных бактерий, как сальмонеллы, клостридии, листерии.

Бактериоцины, продуцируемые лактобактериями (гельветицин, лактобревин, булгарицин, реутерин, лактоцины, плантарицин, лактолин.лактоцидин) способны подавлять размножение широкого спектра микроорганизмов: клостридии, стрептококков, энтеробактерий, листерии, грибов рода Кандида и др. [197,220]. Первый из известных бактериоцинов, продуцируемый энтеробактериями, - колицин обладает мощным ингибирующим действием в отношении бактерий семейства Enterobcteriacaea. Важным свойством бактерий, вырабатывающих бактериоцины является их устойчивость к синтезируемым субстанциям.

Способность к образованию колицинов не является постоянным свойством бактерий вида E.coli. Она связана с Col-факторами (или Col-плазмидами). Существует классификация колицинов по перекрестной устойчивости/ толерантности бактерий, однако это свойство отражает не столько организацию самого колицина, сколько свойство бактериальной клетки в целом. По генетическим характеристикам самих колицинов, механизму их действия на бактериальную клетку была предложена их классификация (таблица 2) [59].

Колицины - это белки. В небольших количествах они присутствуют в супернатанте соответствующей колициногенной культуры. Продукция колицинов повышается на несколько порядков при индукции, т. е. при воздействии на колициногенные бактерии таких агентов, как УФ и радиоизлучение, митомицин С. Роль генетической системы lexA доказывается наличием в промоторе гена продукции колицина сайта связывания с белком LexA [124]. Синтез колицина летален: продуцирующая колицин клетка гибнет. Открытие генов лизиса, являющихся частью того же оперона, что и гены продукции колицинна, показывает, что, пока существует иммунность, летальный эффект не связан с действием самого колицина. Наиболее изученным количином является колицин Е1, синтез которого кодирует плазмида Со1Е1, основные гены которой и выполняемые ими функции представлены в таблице 3.

Антагониститческая активность бактерий нормофлоры доказана в экспериментах in vitro, с использованием методов отсроченного антагонизма, совместного культивирования, а так же in vivo [15,120]. Выяснению существенных деталей антагонистических взаимоотношений между микроорганизмами кишечного биоценоза способствует проведение экспериментов на моделях, с использованием перевиваемых клеточных культур, развивающихся куриных эмбрионов, изолированной петли кишечника, кератоконъюнктивальной пробы и др. [54].

Установлено участие бактерий нормальной микрофлоры в ферментативной деятельности пищеварительного тракта. И, хотя некоторые из ферментов могут играть роль проканцерогенов, их мутагенная активность тесно связана с характером субстрата и является субстрат - индуцированной. Продуцируемые нормальной микрофлорой органические кислоты, особенно ацетат и бутират, напротив, являются антиканцирогенами. Способность бактерий нормофлоры синтезировать ферменты, расщепляющие сахара, особенно лактозу, крайне важна у младенцев с лактазной недостаточностью и при неинфекционных заболеваниях кишечника, например, болезни Крона [38,45,61,62]. Важную роль играет микрофлора кишечника в метаболизме белков, азот- и углеродсодержащих соединений, липидов, желчных кислот, холестерина, ряда и микроэлементов.

Микрофлора кишечника участвует во всасывании солей кальция и железа, регулирует моторную активность толстой кишки, поддерживает водный, газовый, ионный гомеостаз организма, связывает и разрушает токсические субстанции, инактивирует избыток пищеварительных ферментов [38,45,61,62]. Большое значение предается нормофлоре кишечника в защите организма от токсических элементов экзогенного происхождения. Микрофлора кишечника совместно с системами энзимного и иммунного гомеостаза участвует в активации или инактивации лекарственных препаратов, в частности антибиотиков. Бактериальной флоре пищеварительного тракта свойственно участие в синтезе витаминов, в первую очередь витамина К, витаминов группы В. Нормофлора способствует всасыванию витамина D [15,35,45,47].

Важным вкладом бактерий нормальной микрофлоры в обеспечении КР организма является их иммуномодулирующее действие. Установлено влияние низкомолекулярных метаболитов, продуцируемых микрофлорой, на синтез и накопление в кишечном соке секреторного IgA. Непосредственным стимулом пролиферации синтезирующих IgA клеток в слизистой кишечника являются микробные антигены. Бактерии нормофлоры повышают фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов; признана их способность модулировать гуморальный иммунитет, число В лимфоцитов и уровень специфических антител; тогда как в вопросе о регуляция Т клеточного иммунитета и продукции цитокинов единого мнения нет. Ценным свойством бактерий нормофлоры является модулирующее действие на продукцию интерферонов: так имеются данные о противовирусном действии L. casei в отношении цитомегаловируса [35].

Одна из основных функций индигенной нормофлоры, обеспеченивающая колонизационную резистентность макроорганизма - адгезия микробов к рецепторам слизистой оболочек кишечника. Способность штаммов нормофлоры связываться с теми или иными рецепторами поверхности слизистой обеспечивает конкуренцию за эти рецепторы с патогенными и условно-патогенными микроорганизмами. Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, могут находиться как на поверхности слизистой оболочки кишечника, будучи интимно с ней связанными (индигенная, мукозная или М-флора), так и в просвете кишки (просветная, полостная или П-флора). Представители М-флоры фиксируются к строго определенным рецепторам эпителиальных клеток [233]. Число таких рецепторов на эпителиальных клетках ограничено. Это подтверждается наблюдениями, свидетельствующими о том, что предварительная обработка мишеней лектином КонА или адгезинами бактерий резко снижает количество микроорганизмов, способных фиксироваться на преинкубированных клетках.

Считается, что адгезированные бактерии нормофлоры «блокируют» рецепторы эукариотических клеток, делая их недоступными для связывания с патогенными агентами [186]. Механизмы, отвечающие за процесс специфической адгезии индигенных микроорганизмов, в последние годы интенсивно исследуются. Установлено, что одним из элементов, ответственных за нее, являются поверхностные структуры бактерий, содержащие адгезины, которые комплементарны соответствующим рецепторам, расположенным на мембранах эпителиоцитов. Адгезины могут быть локализованы в мембранах бактерий, на их поверхности, а также на специфических фимбриях, которые способны, пенетрируя сквозь толщу экзополисахаридного гликокаликса, фиксировать бактерии на соответствующих рецепторах. Адгезия бактерий может осуществляться и к рецепторам, локализованным в муциновом слое прикрытых другими микроорганизмами (опосредованная адгезия).

При этом едва уловимые изменения в рецептор-связывающем участке адгезина могут оказать значительное влияние на тропизм адгезирующего микроба. Своеобразие рецепторов детерминируется генетически у каждого индивидуума, о чем свидетельствует наличие почти полностью идентичной анаэробной и аэробной флоры у однояйцовых, но не у разнояйцовых близнецов человека [15,62].

Существует три варианта методических подходов к изучению in vitro адгезии микробных клеток к мишеням. Первый предполагает регистрацию факта взаимодействия клеток с помощью светового микроскопа. Второй включает приемы культивирования для учета жизнеспособных микроорганизмов, прикрепившихся к клеткам-мишеням. Третий предусматривает введение изотопной метки ( 3Н или 18С ) и дальнейший учет связавшихся микробных клеток по этой метке.

В норме, находясь в состоянии динамического равновесия, представители кишечной микрофлоры не оказывают отрицательного влияния на организм. Однако, вследствие различных нарушений (сдвиг иммунологического статуса, приема антибактериальных препаратов, инфекционный процесс, стресс, травма и т.д.) бактерии нормофлоры начинают усиленно размножаться и могут заселять нетипичные для них экологические ниши, становясь причиной аутоинфекций [44,246,270,271]. Перенос интестинальных бактерий через слизистую оболочку кишечника, их прохождение через систему мезентериальных лимфатических узлов и воротной вены печени в органы получил название транслокации [41,90,149,186,270,271]. Термин транслокация впервые появился в 19 веке (С. Edmiston и R. Condom), в 1973 году Затула СР. и Резник СР. показали, что введенные per os Bacillus subtilis могут проникать в органы и кровь животных [54].

В 1979 году R. Berg A. Garlington на гнотобиотической модели обнаружили транслокацию индигенной микрофлоры кишечника в мезентерилаьные лимфатические узлы и другие экстраинтестинальные органы [90]. Позднее, в 1985 году Никитенко В. продемонстрировал транслокацию бактерий из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в рану и окружающие ее ткани [41]. Описаны три главные причины, содействующих бактериальной транслокации из ЖКТ: резкое увеличение количества бактерий в ЖКТ, иммунодефицит, повышение проницаемости слизистого барьера кишечника. Из аутофлоры наиболее часто транслоцируется кишечная палочка, протей и энтеробактерии, из транзиторных штаммов - сенная палочка. Следующими в ряду идут грамположительные аэробы. Уровень транслокации облигатных анаэробов очень низок [41,90].

Представители достаточно экологически пластичного вида E.coli, попадая из обычного для них биотопа толстого кишечника и илеоцекальной области подвздошной кишки в иные органы (вышележащие отделы кишечного тракта, кровь, урогенитальную и дыхательную систему) расценивается как признак кишечного дисбактериоза и симптом внекишечного эшерихиоза [47]. Уровень транслокации грамотрицательной микрофлоры у мышей в мезентериальные узлы увеличивает пероральное введение антибактериальных препаратов, снижающих количество анаэробных бактерий (пенициллин, метронидазол, клиндамицин); антибиотики, снижающие уровень аэробной микрофлоры, напротив уменьшают транслокацию [90,149]. Транслокация происходит более выражено за счет таких факторов, как геморрагический шок, кишечная непроходимость, опухоли, нарушения целостности слизистой кишечника и многих других [90].

Запрос на полный текст диссертации присылайте на адрес kulseg@mail.ru

Биология
Ветеринария
География
Искусствоведение
История
Культурология
Медицина
Педагогика
Политика
Психология
Сельхоз
Социология
Техника
Физ-мат
Филология
Философия
Химия
Экономика
Юриспруденция

Подписаться на новости библиотеки

Пишите нам
X