Библиотека ДИССЕРТАЦИЙ

Главная страница Каталог

Новые диссертации Авторефераты
Книги
Статьи
О сайте
Авторские права
О защите
Для авторов
Бюллетень ВАК
Аспирантам
Новости
Поиск
Объявления
Конференции
Полезные ссылки

Введите слово для поиска

Киташова Александра Анатольевна.
Реакции врожденного и приобретенного иммунитета у рыб в естественных и экспериментальных условиях

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет

Специальность 03.00.10 - ихтиология, 14.00.36 - аллергология и иммунология

Диссертация
на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Кондратьева И.А.

Содержание диссертации
Реакции врожденного и приобретенного иммунитета у рыб в естественных и экспериментальных условиях

Список сокращений и обозначений

1. Введение

2. Обзор литературы
2.1. Органы и ткани иммунной системы рыб
2.1.1. Почка
2.1.2. Тимус
2.1.3. Селезенка
2.1.4. Скопления лимфоцитов, ассоциированные со слизистыми оболочками внутренних органов
2.1.5. Ткань эпикарда
2.1.6. Краниальный гемопоэтический орган
2.1.7. Периферическая кровь
2.2. Клетки иммунной системы рыб
2.2.1. Гранулоциты
2.2.2. Макрофаги
2.2.3. Неспецифические цитотоксические клетки
2.2.4. Лимфоциты
2.3. Факторы гуморального иммунитета рыб
2.3.1. Факторы врожденного иммунитета
2.3.2. Факторы приобретенного иммунитета
2.4. Развитие иммунного ответа
2.4.1. Первичный и вторичный иммунный ответ, формирование специфической памяти
2.4.2. Трансплантационные реакции
2.4.3. Реакции гиперчувствительности
2.4.4. Противоопухолевая активность
2.5. Регуляция иммунной системы
2.6. Болезни рыб
2.6.1. Краткая характеристика болезней рыб
2.6.1.1. Инфекционные заболевания
2.6.1.2. Инвазионные заболевания
2.6.1.3. Болезни смешанного типа
2.6.2. Методы профилактики и лечения заболеваний рыб
2.6.2.1. Использование химиотерапевтических препаратов
2.6.2.2. Вакцинация
2.6.2.3. Пассивная иммунизация
2.6.2.4. Повышение иммунитета путем селекции

3. Цель и задачи исследования

4. Объекты и методы исследования
4.1. Объекты
4.1.1. Радужная форель Salmo gairdneri (Richardson, 1836)
4.1.2. Северная навага Eleginus navaga (Pallas, 1811)
4.1.3. Беломорская треска Gadus morhua maris-albi (Derjugin, 1920)
4.2. Методы
4.2.1. Отлов и содержание морских рыб
4.2.2. Клинический осмотр рыб
4.2.3. Вскрытие рыб и осмотр при вскрытии
4.2.4. Бактериологическое исследование
4.2.5. Паразитологическое исследование
4.2.6. Взятие крови и получение сыворотки
4.2.7. Подсчет форменных элементов крови
4.2.8. Определение скорости оседания эритроцитов
4.2.9. Определение концентрации гемоглобина в крови
4.2.10. Определение цветного показателя крови
4.2.11. Двуступенчатый электрофорез сывороток крови рыб в полиакриламидном геле, содержащем додецил-сульфат натрия, в восстанавливающих условиях
4.2.12. Компьютерная обработка электрофореграмм
4.2.13. Определение концентрации лизоцима в сыворотке
4.2.14. Выделение иммуноглобулинов
4.2.15. Определение концентрации белка по методу Бредфорд
4.2.I6. Спектрофотометрическое определение концентрации белка
4.2.17. Получение антисыворотки
4.2.18. Получение разрушенных клеток бактерий
4.2.19. Твердофазный иммуноферментный анализ
4.2.19.1. Непрямой твердофазный ИФА для тестирования антисыворотки кролика к иммуноглобулинам рыб
4.2.19.2. Прямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочего разведения конъюгата
4.2.19.3. Непрямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочей концентрации иммуноглобулинов кролика
4.2.19.4. Непрямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочего разведения клеток бактерий
4.2.19.5. Непрямой твердофазный ИФА для стандартизации рабочей концентрации разрушенных ультразвуком клеток бактерий
4.2.19.6. Непрямой твердофазный ИФА для определения взаимодействия сывороток рыб с поверхностными антигенами бактерий
4.2.19.7. Непрямой твердофазный ИФА для определения взаимодействия сывороток рыб с антигенами разрушенных ультразвуком клеток бактерий
4.2.19.8. Получение данных с помощью компьютера
4.2.20. Статистическая обработка данных

5. Экспериментальные результаты и их обсуждение
5.1. Исследование параметров врожденного иммунитета радужной форели, наваги и трески в зависимости от инфекции и зараженности паразитами
5.1.1. Изучение иммунологических и гематологических показателей радужной форели при энтерите и исследование действия лекарственных препаратов
5.1.1. Клинический осмотр и патологоанатомическое исследование
5.1.2. Бактериологический анализ
5.1.3. Паразитологический анализ
5.1.4. Изучение гематологических показателей
5.1.5. Сравнение электрофореграмм сывороток рыб
5.1.6. Определение концентрации лизоцима в сыворотках рыб
5.2. Исследование зависимости иммунологических и гематологических показателей наваги и трески Белого моря от зараженности паразитами
5.2.1. Морфологические параметры рыб
5.2.2. Показатели зараженности рыб скребнем Echinorhynchus gadi
5.2.3. Бактериологический анализ
5.2.4. Изучение гематологических показателей
5.2.5. Определение концентрации белка в сыворотках рыб
5.1.2.6. Сравнение электрофореграмм сывороток рыб
5.1.2.7. Определение концентрации лизоцима в сыворотках рыб
5.2. Исследование специфического иммунитета радужной форели
5.2.1. Оптимизация метода твердофазного иммуноферментного анализа и экспериментальная разработка тест-системы для изучения специфического взаимодействия сывороток рыб с возбудителями заболеваний
5.2.1.1. Выделение иммуноглобулинов из сыворотки рыб
5.2.1.2. Получение поликлональной антисыворотки и поликлональных антител кролика к иммуноглобулинам рыб
5.2.1.3. Подбор условий для проведения твердофазного ИФА
5.2.2. Применение метода твердофазного иммуноферментного анализа для определения специфического взаимодействия сывороток рыб с возбудителями энтерита радужной форели

6. Заключение
7. Выводы
Литература

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

2-МЭ - 2-меркаптоэтанол
БСА - бычий сывороточный альбумин
ДСН - додецил-сульфат натрия
ДЭАЭ - диэтиламиноэтил
ИФА - иммуноферментный анализ
МНС - главный комплекс гистосовместимости
МПА - мясопептонный агар
МПБ - мясопептонный бульон
ОФД - дигидрохлорид орто-фенилендиамина
ПААГ - полиакриламидный гель
ПДГ - среда, содержащая пептон, дрожжевой экстракт и глюкозу
ПСА - персульфат аммония
СОЭ - скорость оседания эритроцитов
ТЕМЭД - тетраметилэтилендиамин
Трис - тригидроксиметиламинометан
НС1 1 М - раствор соляной кислоты
IgM - иммуноглобулин класса М

1. ВВЕДЕНИЕ

В последние годы в связи с развитием рыбоводства и увеличением промысловой добычи рыбы в пресноводных водоемах, морях и океанах возрос интерес к изучению иммунной системы и иммунного ответа у рыб. Исследования иммунитета рыб можно разделить на три основных категории.

1. Сравнительные и эволюционные исследования

Изучение иммунной системы рыб внесло существенный вклад в развитие сравнительной и эволюционной иммунологии. Галактионов указывает: «на эволюцию специфического иммунитета не следует смотреть только как на самостоятельное явление исторического развития; скорее, ее следует оценивать как такой процесс, который обеспечил прогресс в мире животных по линии увеличения у абсолютного количества соматических клеток» [Галактионов, 1998, с. 391]. Первые исследования, связанные со строением органов иммунной системы рыб, относятся к 1920-м-1940-м годам: например, труд Г.Н.Калашникова (1939) посвящен клеточному составу крови рыб, работа А.К. Скворцова (1947)— строению селезенки костистых рыб. Позднее появились труды Zapata о структуре лимфоидных органов рыб [Zapata, 1979; 1980] и Ellis, посвященные функционированию лейкоцитов рыб [Ellis, 1977; 1980; 1986].

В 1990-х годах в связи с разработкой новых методов, таких как иммунохимические методы, гибридомная технология, анализ ДНК и генно-инженерные технологии, ученые стали уделять большое внимание молекулярным механизмам иммунитета [Cadwell et al,, 1990; Bengten et al., 1991; Abelli et al., 1996; 1997; 1999; Scapigliati et al., 1999a; Secombes et al., 1999]. Исследования иммунной системы прояснили эволюционное положение у рыб и внесли вклад в понимание структурного и функционального становления обладают всеми основными элементами специфической иммунной системы высших позвоночных, но различные регуляторные механизмы иммунного ответа у рыб менее развиты.

Однако до сих пор нет целостной картины организации и функционирования иммунной системы рыб. Основной причиной недостаточности знаний является противоречивость накопленных данных, обусловленная, прежде всего, большими различиями между классами и группами рыб: ДНК хрящевых и костистых рыб отличаются по степени гибридизации больше, чем ДНК птиц и млекопитающих [Медников и др., 1973].

2. Исследования, связанные с промышленным разведением рыб

При разведении рыб в аквакультуре условия их содержания должны благоприятствовать оптимальной активности врожденного иммунитета. В этом направлении были проведены исследования влияния условий содержания на параметры иммунитета рыб. Было показано, что иммунитет рыб в значительной мере зависит от внешних воздействий, и условия среды обитания представляют системы иммунитета млекопитающих. Так, было показано, что рыбы наряду с врожденным иммунитетом, свойственным и низкоорганизованным животным, собой активные регуляторы иммунореактивности рыб.

Современное рыбоводство является неотъемлемым звеном экономического развития России. В последние годы научная база рыбоводства существенно расширилась, однако до сих пор заболевания рыб и способы их лечения изучены недостаточно, и рыбные хозяйства несут большие экономические потери от смертности рыб вследствие болезни. Наиболее эффективным методом контроля заболеваний рыб, вызываемых характерными для аквакультуры патогенами, является вакцинация рыб. Применяют также различные лекарственные препараты, но нет данных о сравнительной эффективности этих средств. Существуют ограничения для успешного применения этих методов, поскольку использование лекарств связано с риском загрязнения ими среды обитания, а вакцина дает защиту только от специфического инфекционного агента, в случае появления новых болезней требуется разработка новых вакцин.

Поэтому проводятся исследования, с одной стороны, вирулентности и патогенности бактерий, характерных для рыб, содержащихся в рыбных хозяйствах, изучение этиологии и биологии паразитов рыб, а с другой стороны - факторов, влияющих на иммунный ответ рыб и усиливающих его. Изучаются возможности применения иммуностимулянтов — эволюционно консервативных веществ, свойственных микроорганизмам и стимулирующих реакции врожденного иммунитета у животных. Кроме того, изучаются возможности селективного разведения устойчивых к заболеваниям рыб.

Наконец, перспективными представляются разработка и производство простых в применении, надежных и высокочувствительных тест-систем для диагностики болезней рыб.

3. Изучение показателей иммунитета рыб как биоиндикация состояния водной среды обитания

В последнее время в связи с ростом техногенного воздействия на среду обитания и возникновением угрозы для выживания и здоровья живых организмов параметры иммунитета рыб используются как показатели загрязнения воды в реках, озерах и морях. Наиболее широко используются такие иммунные параметры, как концентрация лизоцима, антител и лейкоцитов в крови рыб, а также тесты функциональной активности комплемента, макрофагов и лимфоцитов. Поллютанты не только оказывают вредное воздействие на животных, но и нарушают естественное развитие экосистемных процессов. Поллютанты могут подавлять функции иммунной системы рыб или приводить к развитию реакций гиперчувствительности и аутоиммунных реакций из-за дисфункции механизмов регуляции иммунной системы, тем самым участвуя в нарушении гомеостаза организма рыб [Cossarini-Dunier et al., 1990; Hart et al., 1997; Baumann, 1998; O'Halloran et al., 1998; Aaltonen et al., 2000; Dethloff et al., 2001; Regala et al., 2001].

В результате наблюдается увеличение количества заболевших рыб, возрастание интенсивности и экстенсивности зараженности рыб паразитами, изменение восприимчивости рыб к условно-патогенным симбионтам микрофлоры кишечника.

Кроме того, загрязняющие вещества могут действовать как канцерогены [Grizzle et al., 1981; Baumann, 1998]. Оценка параметров иммунной системы морских и пресноводных рыб позволяет получать достоверную информацию о состоянии животных в естественных условиях обитания и о качестве среды, а также проводить биотестирование и биомониторинг техногенного воздействия на среду обитания диких видов. Кроме того, учет симбионтов рыб (паразитов, бактерий) позволяет оценивать биоразнообразие в экосистемах и прогнозировать развитие протекающих в экосистемах динамических процессов. Влияние токсических веществ и других промышленных отходов на иммунную систему рыб стало предметом иммунотоксикологии.

Как известно, иммунная система представляет собой защитную систему, в результате действия которой поддерживается постоянство внутренней биологической среды организма, то есть развивается иммунитет1 к чужеродным агентам молекулярной, надмолекулярной и клеточной организации, уничтожаются собственные измененные клетки и нейтрализуются продукты их жизнедеятельности. В иммунной системе позвоночных животных выделяют две основных составляющих— врожденную и приобретенную, каждая из них представлена клеточными элементами и продуцируемыми ими веществами — гуморальными факторами иммунитета [Ярилин, 1999].

Врожденная составляющая иммунной системы позвоночных формируется в процессе естественного развития организма, и механизмы, относящиеся к этой части иммунной системы, называют также естественными. Они начинают действовать сразу после любого воздействия, которое нарушает целостность внутренней среды организма, то есть являются неспецифическими. Действие врожденных механизмов иммунитета кратковременно и неизбирательно, то есть не зависит от уникальных особенностей активизировавшего защитные реакции чужеродного агента. При повторной встрече с чужеродным агентом клетки и гуморальные факторы естественного иммунитета не «узнают» его и реагируют на него так же, как и при первом контакте, то есть не происходит формирования иммунологической памяти. Это звено иммунитета позвоночных животных имеет много общих черт с защитными реакциями беспозвоночных [Фонталин, 1998].

Приобретенная составляющая иммунной системы позвоночных, или антигенраспознающая система, уникальна тем, что формирование этой системы происходит в течение всей жизни организма в результате контакта с различными В агентами— чужеродными или измененными собственными субстанциями, вызывающими в организме развитие специфических иммунных реакций. Эти реакции направлены только против агента, который активировал каскад иммунного ответа, поэтому приобретенную составляющую иммунной системы называют еще адаптивной. Основой ее являются лимфоциты, несущие на своей поверхности уникальные рецепторы, распознающие антиген и способные взаимодействовать с другими молекулами и клетками иммунной системы. Разнообразие этих рецепторов создается в результате действия генетических и отборочных механизмов, максимизирующих репертуар рецепторов, распознающих антиген, и одновременно минимизирующих риск реагирования на собственные нормальные антигены организма.

Система приобретенного иммунитета позвоночных животных способна узнать чужеродный агент или собственные измененные клетки и макромолекулы, избирательно уничтожить их или нейтрализовать. Одновременно осуществляется запоминание этого агента, формируется специфическая иммунологическая память, и при повторном контакте с ним адаптивные механизмы реагируют более быстро, эффективно и продолжительно.

При развитии иммунного ответа составляющие иммунной системы позвоночных животных— клетки и гуморальные факторы естественного иммунитета и антигенраспознающей системы — действуют взаимосвязанно.

Организация иммунной системы большинства рыб уже во многом предвосхищает организацию иммунной системы высших позвоночных, и рыбы способны к проявлению всех форм иммунного ответа, свойственных млекопитающим. Однако иммунная система рыб более лабильна и восприимчива к изменению внешних условий. С одной стороны, это приводит к тому, что в неблагоприятных условиях у рыб снижается устойчивость к условно-патогенным и непатогенным симбионтам и появляется риск заболевания инфекционными и инвазионными болезнями, вызванными этими организмами [Бауер и др., 1981; Юнчис, 2000]. С другой стороны, такая чувствительность иммунной системы рыб дает возможность разработки новых, более точных, быстрых и недорогих методов определения состояния среды обитания водных животных, воздействия техногенных факторов на живые организмы и характера их ответа [Криксунов и др., 1999; Смуров, 2000].

Иммунная система как система защиты организма от чужеродного воздействия является чрезвычайно чувствительной к токсическому действию химических веществ, присутствующих в очень низких концентрациях, которые не приводят к привычному «очевидно» вредному эффекту. Сегодня в результате экспансии человеческой деятельности практически на все природные зоны и нерационального отношения человека к окружающей природе многие иммунологические параметры рыб стали использоваться как биомаркеры для мониторинга иммунотоксичности химических загрязнителей сред обитания диких видов и для предсказания токсикологического риска, связанного с загрязнением водных сред. Таким образом, исследование показателей иммунной системы рыб не только представляет материал для выявления новых филогенетических связей между различными группами животных, но и служит решению практических задач, биогеоценозов.

Таких как эффективное промышленное разведение рыб, экологическое моделирование и достоверное предсказание изменений экологической обстановки.

3. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы явилось изучение реакций врожденного и приобретенного иммунитета рыб в норме и патологии в естественных и экспериментальных условиях.

В качестве основного объекта исследования были выбраны радужная форель Salmo gairdneri (Richardson, 1836), широко используемая при промышленном разведении, северная навага Eleginus navaga (Pallas, 1811) и беломорская треска Gadus morhua maris-albi (Derjugin, 1920) — распространенные в Белом море виды.

Были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать параметры врожденного иммунитета радужной форели, наваги и трески в норме и при патологии в зависимости от инфекции и зараженности паразитами.
2. Сравнить действие лекарственных препаратов в лечении энтерита радужной форели и выбрать наилучший терапевтический агент.
3. Оптимизировать метод твердофазного иммуноферментного анализа и разработать экспериментальную тест-систему для изучения взаимодействия сывороток рыб с возбудителями заболеваний.
4. Выявить специфическое взаимодействие сывороток радужной форели с возбудителями энтерита с помощью разработанной тест-системы.

4. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Объекты

4.1.1. Радужная форель Salmo gairdneri (Richardson, 1836) Отряд лососеобразные (Salmoniformes) Семейство лососевые (Salmonidae) Род настоящие лососи (Salmo)
4.1.2. Северная навага Eleginus navaga (Pallas, 1811) Отряд трескообразные (Gadiformes) Семейство тресковые (Gadidae) Род наваги (Eleginus)
4.1.3. Беломорская треска Gadus morhua maris-albi (Derjugin, 1920) Отряд трескообразные (Gadiformes) Семейство тресковые (Gadidae) Род треска (Gadus)

4.2. Методы

4.2.1. Отлов и содержание морских рыб
Отлов рыб производили ставными мережами, которые ставили накануне обследования рыб. Пойманную живую рыбу вынимали из мережи и перевозили в емкостях с морской водой. До обработки рыбу содержали в садках, подвешенных к плавучему причалу в море.

4.2.2. Клинический осмотр рыб
При прижизненном наблюдении рыб определяли поведение рыб в садках (подвижность, положение относительно поверхности воды и стен садков), оценивали состояние и окраску покровов, состояние жабр и ануса.

4.2.3. Вскрытие рыб и осмотр при вскрытии
Перед проведением вскрытия рыб взвешивали, измеряли расстояние от переднего конца головы до конца чешуйного покрова и до конца хвостового плавника. Вскрытие рыб проводили вдоль срединной линии брюшка, от анального отверстия до жаберной полости. При вскрытии определяли состояние внутренних органов рыб, брали соскобы для проведения бактериологического и паразитологического исследования.

4.2.4. Бактериологическое исследование
Первичные посевы микроорганизмов из кишечника рыб и микроорганизмов, находящихся на жаберных лепестках рыб, проводили на мясопептонный агар (МГТА), мясопептонный бульон (МПБ) и среду ПДГ (пептон, дрожжевой экстракт, глюкоза— концентрация всех веществ 1 г/л). При исследовании микроорганизмов морских рыб в среды добавляли хлорид натрия (2%). Бактериологические указаниям МСХ РФ и руководствам по бактериологии [Бауер и др., 1981].

Выделенные бактерии идентифицировали по результатам биохимических и морфологических исследований [Берджи, 1997].

4.2.5. Паразитологическое исследование
Паразитологические исследования проводили по стандартным методикам [Бауер и др., 1981; Быховская-Павловская, 1985]. Сбор паразитов производился методом частичных паразитологических вскрытий рыб. Степень зараженности рыб оценивалась долей зараженных рыб (экстенсивностью инвазии), абсолютным количеством паразитов на особь (интенсивностью инвазии) и количеством паразитов одного вида, приходящимся на единицу массы (1 г) тела особи хозяина (удельной интенсивностью инвазии).

4.2.6. Взятие крови и получение сыворотки
Взятие крови у форели проводили из хвостовой артерии, у трески и наваги - из сердца, у кролика — из краевой вены уха [Кондратьева и др., 2001]. Каплю крови наносили на предметное стекло для приготовления мазка. Остальную кровь оставляли для получения сыворотки. После формирования кровяного сгустка сыворотку отделяли центрифугированием при 6 000 g в течение 5 мин, разливали по аликвотам и хранили при —70°С (в зависимости от условий эксперимента допускали хранение сыворотки при -20°С в течение краткого периода времени).

4.2.7. Подсчет форменных элементов крови
Исследование форменных элементов крови рыб (эритроцитов, гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов) проводили на мазках, фиксированных метанолом и окрашенных по Романовскому-Гимза [Иванова, 1983]. Дифференцированный подсчет клеток крови проводили на мазках под иммерсионным объективом при 1000-кратном увеличении. Содержание клеток определяли как долю клеток определенного типа в общем количестве подсчитанных элементов крови. Подсчет эритроцитов и недифференцированный подсчет лейкоцитов проводили также в камере Горяева.

4.2.8. Определение скорости оседания эритроцитов
Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) в крови определяли по Панченкову [Иванова, 1983] в капиллярах Панченкова, смешивая кровь с 5% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 1:4.

4.2.9. Определение концентрации гемоглобина в крови
Концентрацию гемоглобина в крови определяли по стандартной методике [Иванова, 1983] с использованием стандартного реактива компании «Биоконт» (Россия) на фотоэлектроколориметре КФК-2-УХЛ 4.2 (Россия) при длине волны 540 нм.

5. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как известно, иммунная система рыб, подобно иммунной системе млекопитающих и человека, включает врожденную и приобретенную составляющие. Но стратегия защиты у рыб основывается на реакциях врожденного иммунитета, и прежде всего гуморального, позволяющих организму немедленно ответить на агрессию, тогда как адаптивные иммунные механизмы рыб развиты слабо по сравнению со специфической иммунореактивностью высших позвоночных. По данным литературы, одним из основных факторов гуморального врожденного иммунитета у рыб, как и у других животных от моллюсков до млекопитающих, является лизоцим [Fletcher & White, 1973; Fonge et al., 1976; Biggar & Sturgess, 1977; Ourth, 1980; Jolles & Jolles, 1984; Grinde, 1989; Lie et al., 1989; Ottaviani, 1991]. Этот фермент был впервые описан в 1922 г. Флемингом как обнаруженное в тканях и секретах бактерполитическое вещество [Fleming, 1922, цит. по: Paulsen, 2000]. Лизоцим обладает молекулярной массой около 14-15 кДа и гидролизует гликозидные связи пептидогликана бактериальной клеточной стенки.

Таким образом он участвует в борьбе с микробной инфекцией, главным образом с грамположительными бактериями.

Однако данные литературы свидетельствуют, что роль лизоцима в организме не ограничивается ферментативной антибактериальной активностью, как предполагалось ранее. Во-первых, показано, что денатурированный нагреванием лизоцим способен разрушать грамотрицательные бактерии в результате встраивания димерного белка в мембрану прокариот и ее нарушения целостности [Pellegrini et al., 1992]. Во-вторых, выявлено, что он опосредованно стимулирует фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов [Kokoshis & Di Luzio, 1979], обладает противовоспалительной и слабой хитинолитической активностью [Takada et al., 1994], хотя молекулярные аспекты этих функций лизоцима пока не исследованы.

У рыб фермент встречается главным образом в слизи кожи, где он является компонентом первой линии защиты рыб от инфекции, а также в сыворотке крови, экстрактах тканей различных органов и разрушенных макрофагах [Fletcher & White, 1973; Fonge et al., 1976; Ourth, 1980; Jolles & Jolles, 1984; Grinde, 1989; Lie et al., 1989; Hutchinson & Manning, 1996; Paulsen et al., 2000]. Антибактериальные свойства белка были обнаружены у многих видов рыб [Fletcher & White, 1973; Grinde, 1989; Kondratieva et al., 1995]. Менее известна роль лизоцима в борьбе с паразитарной инвазией. Вероятно, это связано с традиционным отношением к белку как к ферменту, действующему на уникальный бактериальный субстрат.

Однако с учетом новых выявленных свойств белка понимание его роли в защите рыб от инвазии представляется необходимым для понимания общего значения лизоцима для организма рыб.

5.1. Исследование параметров врожденного иммунитета радужной форели, наваги и трески в зависимости от инфекции и зараженности паразитами
В данной работе исследовали лизоцим и другие факторы врожденного иммунитета рыб. В качестве модели для изучения врожденных иммунных реакций при бактериальной инфекции была выбрана радужная форель, содержавшаяся в условиях прудового хозяйства. Обычно разводимые в прудовых хозяйствах рыбы характеризуются низкой зараженностью паразитами, но у них часты бактериальные инфекции из-за высокой плотности посадки рыб, нарушений температурных и иных условии содержания и воздействия таких стрессирующих факторов, как перевозки [Бауер и др., 1981; Наумова и др., 1997; Lillehaug А. 1989а]. Моделью для изучения естественной иммунореактивности при паразитарной инвазии были выбраны морские рыбы в естественных условия обитания — навага и треска Белого моря. Для естественных условий обитания менее свойственны инфекционные болезни, однако паразиты являются характерными симбионтами морских рыб [Гиченок, 1996; Безгачина, 2000].

5.7.7. Изучение иммунологических и гематологических показателей радужной форели при энтерите и исследование действия лекарственных препаратов
В работе использовали двухлеток радужной форели массой 500-800 г. Форель выращивали в рыбном хозяйстве «Волгореченское» и затем перевезли для дальнейшего разведения в рыбное хозяйство «Бисерово», где рыб содержали в садках при повышенной температуре (17-20°С) и недостаточности естественных кормов. Как известно, иммунная система рыб чрезвычайно лабильна и чувствительна к изменениям параметров среды обитания [Bly & Clem, 1991; 1992; Scapigliaty et al., 1999b; Zelicoff et al., 2000]. Стрессы и неблагоприятные условия внешней среды снижают иммунитет рыб, как врожденный, так и приобретенный [Киташова и др., 1997; Наумова и др., 1997; Stave & Roberson, 1985; Landolt, 1989; Houghton & Matthews, 1990; Tatner, 1990; Sheldon & Blazer, 1991; Espelid et al., 1996]. У исследуемых рыб в результате стресса, вызванного перевозкой, и плохих условий содержания иммунитет был ослаблен, в кишечнике размножились условно патогенные сапрофитные микроорганизмы, и рыбы, в обычных условиях устойчивые к этим симбионтам, заболели энтеритом.

При клиническом осмотре энтерит отмечали у 20-30% рыб. У них наблюдали необычное поведение (держались у стенок садков или у поверхности воды), уменьшение подвижности, потемнение наружных покровов, покраснение и припухлость ануса. При вскрытии обнаруживали геморрагическое воспаление кишечника, увеличение и изменение цвета печени. Из слизи кишечника заболевших рыб выделили бактерии рода Alkaligenes и бактерии вида Citrobacter freundii. На поверхности кожи обнаружили также эктопаразитов родов Argulus и Diplostomum. У рыб отмечали низкую концентрацию гемоглобина в крови (34 г/л) и высокую скорость оседания эритроцитов— 19 мм/ч. Заболевание было отнесено к заболеваниям смешанного типа с первичной бактериальной инфекцией.

Заболевших рыб (80 экземпляров) разделили на 5 групп по 15—17 особей. Здоровые рыбы (6-я группа) служили контролем. Рыб содержали в долевых садках при температуре 14-16°С. По данным токсико-биологического исследования, проведенного в Республиканской научно-производственной ветеринарной лаборатории по ГОСТ 134967-92, комбикорм, которым кормили форель, был нетоксичен. Исследование воды из садков показало, что по бактериологическим показателям вода была чистая (общее микробное число — единичные микробные клетки/мл, коли-титр — более 2, патогенных микроорганизмов обнаружено не было). В течение недели рыб адаптировали к экспериментальным условиям, затем вместе с кормом рыбам давали лекарственные препараты. В эксперименте испытывали четыре препарата, рекомендуемых специалистами для лечения энтерита рыб [Микитюк, 1984; Ковалев и др., 1989]: нифулин, биовит, кормогризин, бацилихин.

Действующими началами комплексного препарата нифулина являются антибиотик гидрохлорид хлортетрациклина, сульфаниламид нитазол и нитрофуран фуразолидон. Нифулин подавляет размножение и развитие многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

Биовит— это высушенная культуральная жидкость бактерий вида Streptococcus aureofaciens, продуцента антибиотика хлортетрациклина. Природные тетрациклины оказывают бактериостатическое действие на большое число грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. К антибиотикам этой группы чувствительны бактерии родов Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium и другие.

Кормогризин является лекарственной формой гризина— препарата группы антибиотиков-стрептотрицинов, синтезируемого бактериями вида Streptococcus griseus. Гризин обладает широким антибактериальным спектром действия, но относительно слабой активностью. Он подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и стимулирует рост животных. Кормогризин представляет собой высушенную мицелиальную массу Streptococcus griseus с кормовыми добавками.

Бацилихин представляет собой лекарственную форму бацитрацина — антибиотика, относящегося к группе полипептидов и продуцируемого бактериями вида Bacillus licheniformis. Препарат действует главным образом на грамположительные бактерии и почти не влияет на грамотрицательные. Особенно чувствительны к антибиотику бактерии родов Bacillus и Clostridium. Кроме выраженного лечебного действия бацитрацин оказывает ростостимулирующий эффект.

1-я группа заболевших рыб получала нифулин (1 кг/т корма); 2-я группа — биовит-80 (12,5 кг/т корма); 3-я группа— кормогризин-40 (1,2 кг/т корма); 4-я группа— бацилихин-120 (1,5 кг/т корма). 5-я группа лекарств не получала. Биовит, бацилихин и кормогризин давали в течение двух недель с двухдневным перерывом между неделями. Нифулин — в течение одной недели.

По окончании лечения сравнивали данные клинического, патологоанатомического, бактериологического и паразитологического анализа, а также иммунологические и гематологические показатели леченых и нелеченых рыб.

Запрос на полный текст диссертации присылайте на адрес kulseg@mail.ru

Биология
Ветеринария
География
Искусствоведение
История
Культурология
Медицина
Педагогика
Политика
Психология
Сельхоз
Социология
Техника
Физ-мат
Филология
Философия
Химия
Экономика
Юриспруденция

Подписаться на новости библиотеки

Пишите нам
X